趙新燕

（聊城萬合工業(yè)制造有限公司，山東 聊城252022）

石杉堿甲(Huperzine A)是從石杉科植物千層塔[Huperziaserrata(Thumb.)Trev(又名蛇足石杉)]中分離得到的生物堿。它是一種強效、低毒的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑^[1-3]，可用來治療重癥肌無力、跌打損傷和老年癡呆等癥^[4-5]。石杉堿甲片劑已通過衛(wèi)生部審批，在國內(nèi)出售并部分出口國外^[6]。

石杉堿甲治療指數(shù)很高^[7-9]，但在天然產(chǎn)物中的含量很低。傳統(tǒng)的提取工藝是將生藥通過溶劑萃取，上柱層析分離，重結(jié)晶等工序。所要求的技術(shù)含量高，要經(jīng)過多次層析，反復(fù)重結(jié)晶，才能達到較高純度，產(chǎn)量低，條件不易控制，周期長，成本高。本文采用制備型高效液相色譜分離了石杉堿甲，分離工藝簡單，提取率高，所得石杉堿甲質(zhì)量分數(shù)較高（90%以上），為進一步利用制備型高效液相色譜法工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)石杉堿甲提供了實驗依據(jù)。

1  實驗部分

1.1  儀器

高效液相色譜儀含GLP3250泵，可更換泵頭兩個（250ml）,GLP色譜工作軟件，UC-3292檢測器；超聲清洗機，PH測定儀。

1.2  試劑與試藥

氯仿，甲醇，氨水，硫酸，氫氧化鈉，純水（均為分析純）；石杉堿甲對照品（99.1%含量）；千層塔來源于重慶，經(jīng)鑒定符合中華人們共和國藥典（2010版）規(guī)定。

1.3  色譜條件

分析條件：色譜柱（ID4.6×250mm，C18,粒徑5μm）；流動相：甲醇—水（85：15）；流速：1ml/min；檢測波長：231.3nm；進樣體積10μl。

制備條件：色譜柱（ID63×700mm，Diamonsil C18,粒徑25~40μm）；流動相：氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）；流速：40ml/min；檢測波長：311nm；進樣體積5ml。

1.4  樣品的處理

取藥材粉碎，過20目篩，取干燥的千層塔粗粉1.6kg，加入10倍體積的PH為1的硫酸溶液，浸泡一段時間12小時，超生浸提幾分鐘，提取幾次，合并酸液；加氫氧化鈉溶液調(diào)PH至9，再加氯仿反復(fù)提取，并濃縮至膏。

1.5  石杉堿甲的制備

將按照1.4節(jié)方法制備的石杉堿甲固體提取物用制備色譜的流動相配制成體積為10mL的溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，作為制備液。在1.3節(jié)制備色譜條件下開機，待基線穩(wěn)定后進樣，收集相應(yīng)餾分，經(jīng)蒸發(fā)濃縮，結(jié)晶即可，得石杉堿甲晶體。

1.6  制備樣品的質(zhì)量分數(shù)測定

精密稱取按照1.5節(jié)制得的石杉堿甲2mg，用分析色譜流動相定容于10mL容量瓶中。按照石杉堿甲含量測定方法^[10]對所制得的樣品進行石杉堿甲純度檢測,符合質(zhì)量要求。

2  結(jié)果與討論

2.1  流速對分離石杉堿甲的影響

將分析型液相色譜按比例擴大為制備型液相色譜時，盡可能使制備柱的固定相類型、溶劑組分等方面與分析柱保持一致，通常柱長保持大體相同，以增加柱徑來達到更大的柱容量，這樣，只考慮流速問題，可以從下面關(guān)系近似得到最大流速：

制備柱流速=×分析柱流速

根據(jù)石杉堿甲制備條件中流速大小^[11],結(jié)合上式，計算得出大流速為79.38 ml/min。

稱取粉碎干燥的千層塔粗粉1.6kg（共7份），按照1.4和1.5節(jié)操作，以氯仿—甲醇—氨水（840：24:1.2）為流動相，考察不同流速對石杉堿甲分離效果的影響，結(jié)果見表1。

表1可知：隨著流速的增大，石杉堿甲的保留時間逐漸減小，分離度降低，柱壓升高；隨著流速減小，保留時間延長，分離度增大，但流速太小時，保留時間過長，且色譜峰變寬；流速的變化對石杉堿甲純度的影響不是很大，所以為了縮短分離時間，且保持良好的分離度，選擇流動相的流速為40ml/min。

2.2  進樣質(zhì)量濃度對分離石杉堿甲的影響

分別稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1000、1200、1400、1600、1800g，按照1.4和1.5節(jié)進行操作，考察了進樣質(zhì)量濃度對分離石杉堿甲的影響，結(jié)果見表2。

表1  流動相的流速對分離石杉堿甲的影響

由表2可知：隨著進樣質(zhì)量濃度增大，保留時間逐漸增大，分離度降低，洗脫時間延長，所得石杉堿甲的質(zhì)量分數(shù)降低；進樣質(zhì)量濃度低時分離度較高，洗脫時間較短，所得石杉堿甲的質(zhì)量分數(shù)較高，但生產(chǎn)效率下降。為保證所制石杉堿甲既有較高的質(zhì)量分數(shù)，又有較高的生產(chǎn)效率，選擇進樣質(zhì)量濃度為160g(生藥材)/mL。

2.3  進樣量體積對分離石杉堿甲的影響

稱取粉碎、過篩、干燥的千層塔粗粉1600g（共6份），按照1.4節(jié)進行操作，得6份石杉堿甲固體提取物，分別用制備色譜條件中的流動相配置成體積為2、3、4、5、6、7ml的制備樣品溶液，用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，得制備液。按1.3節(jié)制備色譜條件進行純化分離，考察了進樣質(zhì)量體積對分離石杉堿甲的影響，結(jié)果見表3。

表2  進樣質(zhì)量濃度對分離石杉堿甲的影響

表3  進樣量體積對分離石杉堿甲的影響

由表3可知：隨著進樣體積增大，石杉堿甲質(zhì)量分數(shù)先增大又減小，分離度先增大后減小，保留時間逐漸增大，當(dāng)進樣體積大于7mL后，色譜分辨率降低，洗脫時間延長，所得冬凌草甲素的質(zhì)量分數(shù)降低。進樣體積不能太小，否則色譜分辨率太低，冬凌草甲素的質(zhì)量分數(shù)降低。綜合考慮，要分離制得質(zhì)量分數(shù)高的產(chǎn)品，進樣體積以5mL較好。

2.4  石杉堿甲質(zhì)量分數(shù)測量結(jié)果

按照上述2.1-2.3節(jié)確定的條件分離制備了8批石杉堿甲樣品，按照1.6節(jié)條件測定其質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表4，表中數(shù)據(jù)均為3次測定結(jié)果的算術(shù)平均值。

表4  石杉堿甲質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果

由表4可知，采用制備型高效液相色譜法所制得的石杉堿甲的質(zhì)量分數(shù)較高，均能達到Huperzine A的純度大于90%的技術(shù)要求。

3  結(jié)論

我們用制備型高效液相色譜法制備分離石杉堿甲。1.6kg千層塔可以得到近320mg的Huperzine A，重復(fù)性好，產(chǎn)品純度達到了技術(shù)要求。本方法成本低，可為工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供參考。

參考文獻

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