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高效液相色譜硅膠柱柱效的測定研究
2014-09-02查看:
本文通過測定高效液相色譜硅膠柱柱效的實驗結果，表明所用的化合物、流動相、流動相流速、溫度、進樣量、進...
液相色譜法是溶于液態流動相的各組分經過固定相時，由于與固定相發生吸附、分離、離子吸引、排阻、親和等作用的大小、強弱不同，在固定相中滯留時間不同，從而先后從固定相中流出，達到將混合組分分離目的的方法。它的應用，最早可追溯到20世紀初俄國植物學家茨維特（Tswett）利用碳酸鈣吸附作用分離植物色素[1]；液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法。高效液相色譜法(HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，改變色譜柱填料，填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但也會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法[2]。液相色譜十分適合分離混合樣品中的各個組分，高效液相色譜法(HPLC)針對試樣提純目的更具有分離速度快，效率高和應用范圍廣等優越性[3]。目前，高效液相色譜法(HPLC)已在研究開發和工業生產領域得到廣泛應用[4-5]。
柱效是色譜柱對色譜中兩種物質分離能力的大小。高效液相色譜法（HPLC）柱效測定的高低，不僅反映出填料性能，有時也反映出裝填技術的好壞。所以測定柱效無論對生產填料或預裝柱的生產者，還是對使用填料或預裝柱的色譜工作者來說，都是很重要的。通過柱效的測定，生產者可以比較準確的進行質量控制，色譜工作者可根據測定的柱效選擇合適的色譜柱和監督色譜柱使用過程中是否被污染。不同的色譜柱，固然有不同的柱效；但同一根色譜柱，測定柱效使用的方法不同，例如所用的化合物、流動相、流動相流速、溫度、進樣量、進樣體積、半峰寬的測量等等不同，所得到的理論塔板數也不相同。當然，可以對對于所測定的柱效，附上有關的實驗條件，但是，若將柱效的測定方法趨于一致，測定條件大致相同，生產者和色譜工作者會更加方便。
一 實驗部分
1 儀器和試劑
制備型高壓高效液相色譜柱（ID63×630mm）、動態軸向加壓液壓站：聊城萬合工業制造有限公司；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外—可見檢測器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進樣閥（配5ml定量環）；色譜工作軟件及電腦。高效液相色譜儀，高速離心機，旋轉蒸發儀。
二次重蒸水；正己烷，乙酸乙酯，苯，萘，乙苯（均為分析純試劑，使用前先經過整流處理再用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾）。
2 試驗方法
（1）柱效測試液的配制
準確移取苯、萘、乙苯若干于10ml容量瓶中，用正己烷定容，過0.45μm微孔濾膜，即得色譜柱柱效測試液。
（2）色譜條件
流速；
進樣體積；
柱溫：室溫；
檢測波長：UV254nm；
流動相：高效液相色譜（HPLC）中，可做流動相的溶劑很多[6]，然而，日常工作中可有商業提供的溶劑卻很有限[7]。而且經常使用二元或多元溶劑的混合物作為流動相，以調節流動相的極性，改變洗脫強度或流動相的選擇性。本文僅作了一元流動相正己烷和二元流動相正己烷-乙酸乙酯（90:10）、正己烷-乙酸乙酯（80:20）的對比試驗。
3 試驗過程
按照上述色譜條件進行測試，待系統平衡穩定后，用色譜工作站采集色譜數據，同時記錄色譜數據文件名，用其“數據處理”系統處理數據文件并記錄色譜峰的保留時間tR和相應色譜峰的半峰寬Y1/2。
二 結果與討論
色譜柱是高效液相色譜儀的重要組件，無論是在保證純化過程的穩定性還是保證最終產物的安全性上，填充柱的制備和質量認證都是極為重要的步驟。柱效在衡量柱子裝填效果方面具有重要地位，通常用理論塔板數作為衡量指標，理論塔板數越大，柱效越高，分離效果越好。由Martin和Synger首先提出的塔板理論推導出來的理論塔板數柱效計算公式，長期以來被用于評價色譜柱，至今仍在延用[3]。
2 溫度
在高效液相色譜中，柱溫影響著溶質擴散系數和流動相粘度[8]：隨著柱溫的升高，溶質擴散系數增大、流動相粘度降低，從而對保留時間、選擇性產生影響，因此，柱溫影響著理論塔板數的大小。華東理工大學李篤信等[9]等研究了高溫液相色譜中溫度對柱效的影響，得出柱效和溫度的關系：H=a+bT+c/T（a、b、c為常數），升溫過程中可以得到板高的一個最小值，取得最佳柱效。但是，由于受有機溶劑沸點的限制，高效液相色譜中溫度可變化范圍很小，而且溫度升高，容易產生氣泡，若進入柱子的流動相預熱不足，會導致重復性比較差。由于這些原因，測定柱效的溫度建議采用室溫。
3 進樣量和進樣體積
高效液相色譜柱具有一定的飽和容量和最大進樣體積，他們決定于化合物分子在固定相和流動相中的平衡。一般來說，隨著進樣量的增大，柱效降低；當進樣量超出色譜柱的飽和容量時，柱效顯著降低。對于一定的樣品量，進樣體積增大，柱效降低，當超出色譜柱的最大進樣體積時，柱效明顯減低，影響分離效果。對于色譜分析柱，所需要的進樣量和進樣體積都很小，遠遠小于色譜柱的飽和容量和最大進樣體積，因此，進樣量和進樣體積對定性定量的色譜分析柱柱效影響不大。但進樣量和進樣體積對制備型色譜柱柱效測量有很大影響，應注意不要超出色譜柱的進樣飽和容量和最大進樣體積?？傮w來說，在色譜柱的線性容量范圍內，進樣量和進樣體積對柱效的影響不明顯（見表2，流動相為二元流動相正己烷-乙酸乙酯（80:20），試樣為萘，溫度為室溫）。
從上表可以看出，在一定的范圍內，隨著進樣量和進樣體積的變化，理論塔板數值變化不明顯，但超出了這個范圍，柱效明顯降低。
4 流動相流速
1956年荷蘭學者范·第姆特（Van Deemter）等人提出了速率理論[10]，表述了影響柱效的各種因素，提出了流動相流速影響保留時間和色譜峰擴展，并由速率方程（也成范·第姆特方程式）推出流速影響柱效總存在一個最佳流速。對于分析型色譜柱，根據各種經驗，建議采用1ml/min左右的流動相流速。對于制備型色譜柱，一般與直徑的平方成正比，建議利用標準色譜柱[10]和經驗公式：
制備柱流速=（）2×分析柱流速
=（）2×1
=（）2
制備柱內徑單位為mm。
5 半峰寬
峰寬是指峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。半峰寬（p是—峰高一半處的峰寬。半峰寬的測量現在大都可以從工作站軟件中直接得到，影響不大。
6 填料
對于一些非預裝柱，還應考慮填料，應注意填料的生產廠家和生產批號。
三 結論
由以上實驗及分析可以看出，影響柱效測定的因素是很多的。測定的方法不同，得到的柱效肯定不同，所以測得的柱效應附上以上所有實驗條件，否則只說某一填料或柱子的柱效太過籠統，容易產生歧義。所以最好的辦法是使柱效測定方法趨于統一化，至少大體相同，這樣，對填料和柱子的評價有了共同語言，可以減少很多不必要的糾紛。并且，質量控制也有了依據，用戶可以更好的了解產品的性能。
參考文獻
[1] 成都中醫學院編著. 中藥學,上?？茖W技術出版社，1978,1,89，123
[2] 王志祥、莫芬珠、余國琮. 制備型液相色譜分離技術進展,化工時代，1997，11（5），12-17
[3] 陳怡文，等. 有機儀器分析.長沙：湖南大學出版社,1987.
[4] Colin H. Analusis, 1998,（26）：M15-M17
[5] 祁彥（Qi Y）,黃駿雄（Huang J X）. 化學進展（Progress in Chemistry）,2001:13（4）：294-302
[6] L.R.Snyder,J.Chem,Sct. 1978;16:223
[7] S.R.Bakalyar,Amerlcan Laboratory,1978:43
[8] 成洪達，李彤，張維冰。現代科學儀器[J].2006,109：74-78
[9] 李篤信，蘭韜，王風云等.高溫液相色譜中溫度對柱效的影響，第十七屆全國色譜學術報告會及儀器展覽會會議論文集：1150-1151
[10] 劉國詮，余兆樓編. 色譜柱技術. 北京：化學工業出版社，2001
[11] 中華人民共和國機械行業標準，JB-5226-91
柱效是色譜柱對色譜中兩種物質分離能力的大小。高效液相色譜法（HPLC）柱效測定的高低，不僅反映出填料性能，有時也反映出裝填技術的好壞。所以測定柱效無論對生產填料或預裝柱的生產者，還是對使用填料或預裝柱的色譜工作者來說，都是很重要的。通過柱效的測定，生產者可以比較準確的進行質量控制，色譜工作者可根據測定的柱效選擇合適的色譜柱和監督色譜柱使用過程中是否被污染。不同的色譜柱，固然有不同的柱效；但同一根色譜柱，測定柱效使用的方法不同，例如所用的化合物、流動相、流動相流速、溫度、進樣量、進樣體積、半峰寬的測量等等不同，所得到的理論塔板數也不相同。當然，可以對對于所測定的柱效，附上有關的實驗條件，但是，若將柱效的測定方法趨于一致，測定條件大致相同，生產者和色譜工作者會更加方便。
一 實驗部分
1 儀器和試劑
制備型高壓高效液相色譜柱（ID63×630mm）、動態軸向加壓液壓站：聊城萬合工業制造有限公司；制備高壓輸液泵：GLP3250；紫外—可見檢測器：UC-3292；Rheodyne3725i六通進樣閥（配5ml定量環）；色譜工作軟件及電腦。高效液相色譜儀，高速離心機，旋轉蒸發儀。
二次重蒸水；正己烷，乙酸乙酯，苯，萘，乙苯（均為分析純試劑，使用前先經過整流處理再用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾）。
2 試驗方法
（1）柱效測試液的配制
準確移取苯、萘、乙苯若干于10ml容量瓶中，用正己烷定容，過0.45μm微孔濾膜，即得色譜柱柱效測試液。
（2）色譜條件
流速；
進樣體積；
柱溫：室溫；
檢測波長：UV254nm；
流動相：高效液相色譜（HPLC）中，可做流動相的溶劑很多[6]，然而，日常工作中可有商業提供的溶劑卻很有限[7]。而且經常使用二元或多元溶劑的混合物作為流動相，以調節流動相的極性，改變洗脫強度或流動相的選擇性。本文僅作了一元流動相正己烷和二元流動相正己烷-乙酸乙酯（90:10）、正己烷-乙酸乙酯（80:20）的對比試驗。
3 試驗過程
按照上述色譜條件進行測試，待系統平衡穩定后，用色譜工作站采集色譜數據，同時記錄色譜數據文件名，用其“數據處理”系統處理數據文件并記錄色譜峰的保留時間tR和相應色譜峰的半峰寬Y1/2。
二 結果與討論
色譜柱是高效液相色譜儀的重要組件，無論是在保證純化過程的穩定性還是保證最終產物的安全性上，填充柱的制備和質量認證都是極為重要的步驟。柱效在衡量柱子裝填效果方面具有重要地位，通常用理論塔板數作為衡量指標，理論塔板數越大，柱效越高，分離效果越好。由Martin和Synger首先提出的塔板理論推導出來的理論塔板數柱效計算公式，長期以來被用于評價色譜柱，至今仍在延用[3]。
tR—組分的保留時間
Y1/2—色譜峰的半峰寬度
Y—色譜峰的峰底寬度
由以上公式可以看出影響柱效大小的直接因素是保留時間和半峰寬度或峰底寬度，因此，理論塔板數的測定值會受到所用的化合物、流動相、流動相流速、溫度、進樣量、進樣體積、半峰寬的測量等因素的影響。
1 化合物和流動相
測定柱效的主要實驗條件是所用的化合物和流動相，因為這兩者主要涉及保留時間的問題，所以尤為重要。本文選擇了苯、萘、乙苯作為測定的化合物；正己烷和混合物正己烷-乙酸乙酯（90:10）、正己烷-乙酸乙酯（80:20）作為流動相進行測定，測定結果見表1。
Y1/2—色譜峰的半峰寬度
Y—色譜峰的峰底寬度
由以上公式可以看出影響柱效大小的直接因素是保留時間和半峰寬度或峰底寬度，因此，理論塔板數的測定值會受到所用的化合物、流動相、流動相流速、溫度、進樣量、進樣體積、半峰寬的測量等因素的影響。
1 化合物和流動相
測定柱效的主要實驗條件是所用的化合物和流動相，因為這兩者主要涉及保留時間的問題，所以尤為重要。本文選擇了苯、萘、乙苯作為測定的化合物；正己烷和混合物正己烷-乙酸乙酯（90:10）、正己烷-乙酸乙酯（80:20）作為流動相進行測定，測定結果見表1。
表1 不同化合物和不同流動相的柱效
|
流動相體系 |
實驗柱效（N/m） |
||
|
萘 |
苯 |
乙苯 |
|
|
正己烷 |
405268 |
38356 |
39526 |
|
正己烷-乙酸乙酯（90:10） |
41598 |
39645 |
40589 |
|
正己烷-乙酸乙酯（80:20） |
43589 |
40569 |
42287 |
在高效液相色譜中，柱溫影響著溶質擴散系數和流動相粘度[8]：隨著柱溫的升高，溶質擴散系數增大、流動相粘度降低，從而對保留時間、選擇性產生影響，因此，柱溫影響著理論塔板數的大小。華東理工大學李篤信等[9]等研究了高溫液相色譜中溫度對柱效的影響，得出柱效和溫度的關系：H=a+bT+c/T（a、b、c為常數），升溫過程中可以得到板高的一個最小值，取得最佳柱效。但是，由于受有機溶劑沸點的限制，高效液相色譜中溫度可變化范圍很小，而且溫度升高，容易產生氣泡，若進入柱子的流動相預熱不足，會導致重復性比較差。由于這些原因，測定柱效的溫度建議采用室溫。
3 進樣量和進樣體積
高效液相色譜柱具有一定的飽和容量和最大進樣體積，他們決定于化合物分子在固定相和流動相中的平衡。一般來說，隨著進樣量的增大，柱效降低；當進樣量超出色譜柱的飽和容量時，柱效顯著降低。對于一定的樣品量，進樣體積增大，柱效降低，當超出色譜柱的最大進樣體積時，柱效明顯減低，影響分離效果。對于色譜分析柱，所需要的進樣量和進樣體積都很小，遠遠小于色譜柱的飽和容量和最大進樣體積，因此，進樣量和進樣體積對定性定量的色譜分析柱柱效影響不大。但進樣量和進樣體積對制備型色譜柱柱效測量有很大影響，應注意不要超出色譜柱的進樣飽和容量和最大進樣體積?？傮w來說，在色譜柱的線性容量范圍內，進樣量和進樣體積對柱效的影響不明顯（見表2，流動相為二元流動相正己烷-乙酸乙酯（80:20），試樣為萘，溫度為室溫）。
表2 進樣量和進樣體積對柱效的影響
|
進樣量（g/5ml） |
0.2 |
0.4 |
0.5 |
2 |
5 |
|
柱效(N/m) |
44256 |
44249 |
43895 |
40256 |
36895 |
|
進樣體積(ml/0.5g) |
1 |
2 |
5 |
10 |
15 |
|
柱效(N/m) |
44589 |
44289 |
43956 |
38852 |
35987 |
4 流動相流速
1956年荷蘭學者范·第姆特（Van Deemter）等人提出了速率理論[10]，表述了影響柱效的各種因素，提出了流動相流速影響保留時間和色譜峰擴展，并由速率方程（也成范·第姆特方程式）推出流速影響柱效總存在一個最佳流速。對于分析型色譜柱，根據各種經驗，建議采用1ml/min左右的流動相流速。對于制備型色譜柱，一般與直徑的平方成正比，建議利用標準色譜柱[10]和經驗公式：
制備柱流速=（）2×分析柱流速
=（）2×1
=（）2
制備柱內徑單位為mm。
5 半峰寬
峰寬是指峰兩側拐點處所作兩條切線與基線的兩個交點間的距離。半峰寬（p是—峰高一半處的峰寬。半峰寬的測量現在大都可以從工作站軟件中直接得到，影響不大。
6 填料
對于一些非預裝柱，還應考慮填料，應注意填料的生產廠家和生產批號。
三 結論
由以上實驗及分析可以看出，影響柱效測定的因素是很多的。測定的方法不同，得到的柱效肯定不同，所以測得的柱效應附上以上所有實驗條件，否則只說某一填料或柱子的柱效太過籠統，容易產生歧義。所以最好的辦法是使柱效測定方法趨于統一化，至少大體相同，這樣，對填料和柱子的評價有了共同語言，可以減少很多不必要的糾紛。并且，質量控制也有了依據，用戶可以更好的了解產品的性能。
參考文獻
[1] 成都中醫學院編著. 中藥學,上?？茖W技術出版社，1978,1,89，123
[2] 王志祥、莫芬珠、余國琮. 制備型液相色譜分離技術進展,化工時代，1997，11（5），12-17
[3] 陳怡文，等. 有機儀器分析.長沙：湖南大學出版社,1987.
[4] Colin H. Analusis, 1998,（26）：M15-M17
[5] 祁彥（Qi Y）,黃駿雄（Huang J X）. 化學進展（Progress in Chemistry）,2001:13（4）：294-302
[6] L.R.Snyder,J.Chem,Sct. 1978;16:223
[7] S.R.Bakalyar,Amerlcan Laboratory,1978:43
[8] 成洪達，李彤，張維冰。現代科學儀器[J].2006,109：74-78
[9] 李篤信，蘭韜，王風云等.高溫液相色譜中溫度對柱效的影響，第十七屆全國色譜學術報告會及儀器展覽會會議論文集：1150-1151
[10] 劉國詮，余兆樓編. 色譜柱技術. 北京：化學工業出版社，2001
[11] 中華人民共和國機械行業標準，JB-5226-91
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